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Nov 12, 2023

Alteración no invasiva de la sangre.

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 806 (2023) Citar este artículo 549 Accesos 1 Altmetric Detalles de métricas El mono tití común (Callithrix jacchus) es una especie de creciente prominencia

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 806 (2023) Citar este artículo

549 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

El mono tití común (Callithrix jacchus) es una especie de creciente importancia en las neurociencias debido a su pequeño tamaño, facilidad de manejo, rápida reproducción y sus características cerebrales funcionales y estructurales compartidas con los primates del Viejo Mundo. Con una atención cada vez mayor en el modelado de enfermedades cerebrales humanas en titíes, comprender cómo administrar agentes terapéuticos o neurotrópicos al cerebro de los titíes de forma no invasiva es de gran importancia preclínica. En otras especies, incluidos los humanos, la ecografía transcraneal focalizada (tFUS, por sus siglas en inglés) ayudada por microburbujas inyectadas por vía intravenosa ha demostrado ser un método transitorio, confiable y seguro para alterar la barrera hematoencefálica (BHE), permitiendo el paso focal de agentes terapéuticos que no lo hacen. De otro modo no atravesarían fácilmente las estrechas uniones endoteliales de la BHE. La brecha crítica que abordamos aquí es documentar los parámetros para alterar la BBB de manera confiable y segura en titíes que utilizan tFUS. Al integrar nuestros atlas cerebrales de titíes y el uso de un sistema de orientación estereotáctica específico para titíes, llevamos a cabo una serie de experimentos sistemáticos de sonicación transcraneal en nueve titíes. Demostramos los efectos de la frecuencia central, la presión acústica, el período de explosión y la duración, establecemos una dosis mínima de microburbujas, estimamos el tiempo de eliminación de las microburbujas y estimamos el tiempo que la BHE permanece abierta al paso. Se informa una interrupción exitosa de la BHE in vivo con agentes de contraste basados ​​en resonancia magnética, así como con tinción con azul de Evans evaluada ex vivo. La histología (tinción con hematoxilina y eosina) y la inmunohistoquímica indican que la BBB se puede abrir de forma segura y confiable con los parámetros derivados de estos experimentos. La serie de experimentos presentados aquí establecen métodos para perturbar de forma segura, reproducible y focalizada la BBB utilizando tFUS en el mono tití común que puede servir como base para la administración no invasiva de agentes terapéuticos o neurotrópicos.

El objetivo de este manuscrito es establecer parámetros para alterar de forma segura la barrera hematoencefálica (BHE) en el mono tití común (Callithrix jacchus), una especie de creciente importancia en las neurociencias. La BHE regula la permeabilidad de las moléculas al parénquima cerebral, formada por un endotelio capilar que impide la entrada de moléculas con un peso de ~400 Da1. En otras especies de modelos preclínicos (p. ej., ratas, ratones, macacos, conejos, cerdos), el ultrasonido focalizado transcraneal (tFUS) se ha convertido en un medio confiable para eludir las inyecciones intracerebrales invasivas y permitir la administración del agente mediante la interrupción transitoria de la BHE2,3,4. 5,6,7,8,9. El valor de aplicar tFUS para alterar local y no invasivamente la BHE en el modelo de tití es potencialmente tremendo; por ejemplo, al aprovechar el corto intervalo entre nacimientos y la vida útil relativamente corta del tití, tFUS se puede utilizar como un método longitudinal y no invasivo de neuromodulación10. rastreo neuronal11,12 o incluso administración focal de fármacos13 para un modelo de enfermedad a lo largo de la vida. Con una corteza lisencéfala y una arquitectura cortical que es más similar a la de los humanos que a la de los roedores14,15,16,17, los titíes son ideales para tFUS, ya que permiten una orientación simplificada a través de la corteza en comparación con los cerebros altamente plegados de otras especies de primates.

La brecha crítica que se aborda aquí es documentar la capacidad de abrir de manera confiable y no invasiva la BHE en el tití utilizando tFUS con la ayuda de cavitación de microburbujas. Las microburbujas son micelas microscópicas (~1–10 μm) llenas de gas que pueden inyectarse sistémicamente justo antes de la estimulación ultrasónica18. A presiones acústicas más bajas, las microburbujas oscilan (cavitación estable) y cuando se exponen a una presión suficiente pueden colapsar (cavitación inercial) y liberar un potente chorro de líquido a través del endotelio que puede potenciar la administración del agente18,19,20. Dado que se ha demostrado que una gran cantidad de agentes neuromoduladores o terapéuticos disponibles cruzan la BHE como resultado de la cavitación de microburbujas mediada por ultrasonido13,21,22,23, comprender los parámetros para abrir la BHE en el tití conducirá inevitablemente a numerosas aplicaciones neurocientíficas. Esperamos que esta técnica tenga una amplia aplicación en la investigación traslacional de titíes, especialmente para aplicaciones de desarrollo neurológico, proporcionando un medio para rastrear la aparición neuropatológica de la disfunción del circuito de forma no invasiva desde una edad temprana.

Mediante la combinación de un atlas específico de tití (límites citoarquitectónicos registrados24 en el espacio de resonancia magnética25,26) y un aparato de ultrasonido enfocado específico de tití ahora disponible comercialmente (Fig. 1; RK-50 Marmoset, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Canadá) , demostramos los parámetros necesarios para apuntar estereotácticamente y abrir de manera confiable la BHE a un pequeño volumen parenquimatoso (~ 10–20 mm3) con un transductor de un solo elemento de 1,46 MHz. Demostramos los efectos de la frecuencia central sobre el tamaño de la alteración de la BBB, la atenuación acústica debida al cráneo del tití, la presión acústica mínima para alterar la BBB y los efectos nocivos de demasiada presión acústica. También demostramos la dosis mínima de microburbujas para la alteración de la BHE a una presión acústica segura, estimamos el tiempo de eliminación de las microburbujas y el efecto del ángulo del cráneo sobre la alteración de la BBB. A través de informes mediante resonancia magnética mejorada con gadolinio in vivo y tinción con azul de Evans ex vivo, así como informes histológicos e inmunohistoquímicos, proporcionamos una descripción detallada de los parámetros necesarios para alterar de forma segura, reproducible y focalizada la BBB en el tití común.

Una representación tridimensional del diseño asistido por computadora del posicionamiento estereotáctico del tití con referencia al transductor y al hidrófono. b Software MORPHEUS (FUS Instruments, Toronto, Ontario, Canadá) con nuestros atlas de titíes integrados junto con límites citoarquitectónicos. c Tamaño relativo de la interrupción de la BBB utilizando un transductor de 515 kHz y 1,46 MHz superpuesto a un atlas de tití. d Tamaño relativo de la alteración de la BBB según lo informado por la tinción con azul de Evans en tití B.

Basándonos en las imágenes de TC de la placa de prueba de acrílico derretido, cuantificamos la distancia euclidiana desde cada punto de sonicación hasta la ubicación objetivo. La figura complementaria 1g muestra la precisión en los 24 puntos de sonicación individuales en el plano XY. El error espacial promedio fue de 220 μm en X, 117 μm en Y y 247 μm en la dirección Z.

Tití B recibió dos sonicaciones en la corteza parietal para determinar la diferencia relativa en el tamaño de la disrupción de la BBB en función de la frecuencia central del transductor. Con el objetivo de minimizar el tamaño de la interrupción, ambos transductores (515 kHz, hemisferio izquierdo; 1,46 MHz, hemisferio derecho) se enfocaron en el borde de la corteza (Fig. 1c); en consecuencia, solo aproximadamente la mitad del haz ultrasónico en el La orientación axial se centró en el tejido cerebral. Como lo demuestra la tinción con azul de Evans (Fig. 1d), ambas sonicaciones tuvieron un volumen cercano al ancho total en la mitad del máximo de la distribución de presión acústica en el foco (con 515 kHz a 188 mm3 y 1,46 MHz a 10 mm3). Con el fin de demostrar las perturbaciones focales de la BBB en experimentos posteriores, sólo se utilizó el transductor de mayor frecuencia de 1,46 MHz. Como se demostró de manera confiable en los experimentos que se describen a continuación, el método de centrar el foco del transductor de 1,46 MHz en la parte superior de la corteza permitió interrupciones del orden de 1 mm radialmente y 2,5 mm axialmente. De hecho, el tamaño de la disrupción varió ligeramente en función de la presión acústica, la dosis de microburbujas, la duración de la ráfaga y el número de ráfagas, pero con los parámetros "seguros" que se muestran a continuación, el transductor de 1,46 MHz permitió alteraciones corticales dentro de los límites de la mayoría de las alteraciones citoarquitectónicas corticales. regiones de interés (p. ej., encajan dentro de la extensión medial-lateral del área MIP).

Los titíes SG, NE y T recibieron cada uno cinco u ocho sonicaciones corticales (área 8a, 4ab, MIP y V2) con un transductor de 1,46 MHz. La Figura 2 muestra las ubicaciones de la sonicación y las presiones acústicas que las acompañan. Con base en los experimentos iniciales en titíes SG que demostraron que las presiones acústicas reducidas de 0,95 a 1,70 MPa (y una dosis alta de microburbujas de 400 μl/kg) permitieron una interrupción confiable de la BBB, los titíes NE y T fueron sonicados con presiones reducidas más bajas de 0,32 a 1,17 MPa. y una dosis de microburbujas más baja de 200 μl/kg para determinar las presiones mínimas a las que la perturbación de la BHE permite la extravasación de GBCA y la tinción con azul de Evans. Como se muestra en la Fig. 2, 0,53 MPa (reducido) perturbó la BHE en tití NE, pero no en tití T. 0,74 MPa (reducido) perturbó con éxito la BHE tanto en tití NE como en T, pero hubo un claro sesgo cortical superficial de la distribución de la disrupción BBB más cerca del centro del foco del haz acústico. A una presión reducida de 0,95 MPa, el tití NE mostró una clara perturbación en un tamaño que se aproximaba al volumen del ancho total a la mitad del máximo de la distribución de presión acústica en el foco (2,5 mm axialmente por 1 mm radialmente), pero menos en el tití T. A 1,17 MPa (reducido), los titíes SG, NE y T mostraron una alteración constante (tenga en cuenta que la dosis del agente GBCA para los titíes SG fue inferior a 0,1 ml/kg, pero consulte la fotografía de la tinción con azul de Evans en la Fig. 2 a 1,17 MPa). ).

a Interrupción resultante de la BHE en ocho sonicaciones a través de la corteza de tití SG mostrada mediante extravasación de azul de Evans en tití SG. b Extravasación de GBCA mediante resonancia magnética in vivo en Marmoset SG. c, d Igual que (a, b) en Tití NE que fue sonicado a presiones acústicas más bajas. e, f Igual que (c, d) en Marmoset T.

Los hemisferios derechos de los titíes NE y T se usaron para determinar la presión acústica mínima (Fig. 2), mientras que el hemisferio izquierdo se usó para demostrar la dosis mínima de microburbujas necesaria para perturbar la BHE (Fig. 3). Cada animal fue sonicado cuatro veces (área 8a, 4ab, MIP y V2), utilizándose la dosis de microburbujas más baja para los sitios más posteriores desde 0 µl/kg (V2), y luego aumentando a 20 µl/kg (MIP), 100 μl/kg (4ab) y 200 μl/kg (8a) en los sitios anteriores. Aunque los parámetros (y el tiempo) fueron los mismos para los titíes NE y T, 20 μl/kg perturbaron la BHE en los titíes NE, pero no completamente en los titíes T. En total, 100 μl/kg perturbaron exitosamente la BHE en ambos animales. al igual que 200 μl/kg. Por lo tanto, con nuestro aparato, demostramos que la dosis mínima de microburbujas para inyecciones de un solo bolo en la vena de la cola en titíes está en el rango de 20 a 100 μl/kg a 1,46 MHz.

a Interrupción resultante de la BBB en cuatro sonicaciones con dosis variadas de microburbujas en Marmoset NE. b Extravasación de GBCA mediante resonancia magnética in vivo en Marmoset NE. c, d Igual que (a, b) en Tití T.

Con un total de 12 sonicaciones (8 de las cuales se describen en las dos secciones anteriores), Marmoset T también recibió cuatro sonicaciones (áreas parietales PFG derecha, PE derecha, PE izquierda y PFG izquierda) para determinar la capacidad de alterar la BHE a través de múltiples sitios después de una única inyección en bolo de microburbujas. La Figura 4 muestra las ubicaciones de sonicación 30, 120, 240 y 480 s después de una única inyección en bolo de 200 μl/kg de microburbujas; cada una de las cuatro sonicaciones tenía los siguientes parámetros: presión acústica reducida = 1,17 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60. A 1,17 MPa, solo la sonicación 30 s después de la inyección de microburbujas mostró una perturbación que permitió una extravasación clara de GBCA y tinción azul de Evans en el volumen aproximado en FWHM de la distribución de presión acústica en el foco, como se visualiza en los elipsoides en las figuras 4a-e. Marmoset M compartió los mismos parámetros de sonicación y se usó para determinar la capacidad de interrumpir la BBB a 30, 60, 90 y 120 s (entre los dos primeros puntos de Marmoset T) después de una única inyección en bolo. A partir de estos datos, el tiempo de eliminación efectivo de una dosis de 200 μl/kg de microburbujas disponibles comercialmente (Definity) parece ser inferior a 2 minutos en el cerebro del tití; esperamos que haya cierta variación en la concertación efectiva de las microburbujas intravasculares en función del estado fisiológico del animal (por ejemplo, frecuencia cardíaca, función renal). Sin embargo, la dosis aquí era relativamente alta, 200 μl/kg, por lo que la disponibilidad de burbujas en circulación no podía ser mucho mayor sin provocar daños. En los (otros) experimentos presentados aquí, inyectamos antes de cada sonicación en lugar de usar un solo bolo o infusión para múltiples sonicaciones, con al menos 5 minutos entre inyecciones. Probablemente debido a la variación en el tejido (p. ej., músculo, grasa) entre el sitio sonicado y el hidrófono, no encontramos que el espectro de Fourier de las emisiones de cavitación monitoreadas sea un índice particularmente confiable de perturbación BBB (con la verdad fundamental del azul de Evans). microscopía de tinción). Sin embargo, este experimento brindó la oportunidad de comparar espectros de disrupciones exitosas con aquellas que no tuvieron éxito con parámetros idénticos, variando solo las microburbujas disponibles en circulación. A partir de estas cuatro sonicaciones (tití T), aparecieron ruido de banda ancha y un aumento en la amplitud subarmónica alrededor de la mitad de la frecuencia del transductor (0,73 MHz) en relación con la cavitación correspondiente a la interrupción a los 30 y 120 s después de la inyección de microburbujas, pero solo a los 30 s después de la inyección. -La sonicación de inyección de microburbujas mostró una apertura exitosa de la BBB (Figura complementaria 2).

a Ubicaciones de los objetivos de sonicación para Marmoset T entre 30 y 480 s después de una única inyección en bolo de 200 µl/kg de microburbujas. b Mejora del contraste de GBCA debido a la interrupción exitosa de la BHE en Marmoset T. c Sitios en Marmoset T según lo informado por la tinción con azul de Evans. d Ubicaciones de los objetivos de sonicación para Marmoset M, pero entre 30 y 120 s después de una única inyección en bolo de microburbujas a 200 µl/kg. e Igual que (b), para Marmoset M. Nota: la secuencia de resonancia magnética varió para los titíes T y M debido a que Marmoset M participó en otros experimentos, pero ambos mostraron claramente contraste GBCA ponderado en T1. No se inyectó azul Evans en Marmoset M.

Con efectos conocidos de reflexión acústica mediados por el ángulo y el grosor del cráneo27, intentamos probar directamente estos efectos mediante sonicación a 1,46 MHz en diversos ángulos del cráneo de la cabeza del tití. Como se muestra en la representación del aparato en la Fig. 1, nuestro transductor siempre estuvo paralelo al plano estereotáctico (es decir, el plano Z correspondiente al centro de las barras de las orejas y la parte inferior de las barras de los ojos) y, por lo tanto, se fijó con referencia a las variables. ángulo del cráneo. Además de la resonancia magnética mejorada con GBCA in vivo, se adquirieron imágenes de TC de alta resolución (isotrópica de 50 μm) en tití SP para aislar el cráneo y medir con precisión los ángulos tangentes a la superficie del cráneo (tangente al punto en la intersección del centro axial del elipsoide de sonicación) (Fig. 5). A presión alta (reducida) (1,70 MPa, dosis de microburbujas de 400 μl/kg), el tamaño de la disrupción de la BHE coincidió con el FWHM de la distribución de sonicación esperada, lo que indica que las sonicaciones planas hasta (por encima) del cráneo del tití no se vieron afectadas negativamente por el cráneo. ángulo. En consecuencia, el delgado cráneo de tití (~1 mm o menos) parece ser susceptible al ultrasonido enfocado en comparación con otras especies, con una reducción del 47% medida directamente a través de cráneos de tití aquí. También vale la pena señalar que, aunque la presión acústica y la dosis de microburbujas fueron altas para este experimento, los datos de las Figs. 2, 3, 6 o 7 también demuestran que el ángulo del cráneo parece tener un efecto mínimo con presiones acústicas y dosis de microburbujas más bajas. Debido al enfoque de nuestro transductor (distancia focal = 24,5 mm), todavía tenemos que establecer estos efectos más profundamente dentro del cerebro. Con el transductor utilizado aquí, sólo pudimos centrar efectivamente el haz acústico a 11 mm de la parte superior de la cabeza del tití, lo que limita la capacidad de establecer tales efectos.

una representación tridimensional de la TC de Marmoset SP, con las líneas discontinuas negras que muestran la ventana para la imagen de proyección de máxima intensidad (MIP) que se muestra en (b). b Distribución de la densidad (según el índice de Unidades Hounsfield (HU)) en el cráneo de Marmoset SP con referencia a las ubicaciones de sonicación 1 y 2; aparte de la ubicación, las ubicaciones de sonicación 1 y 2 comparten los mismos parámetros y dosis de microburbujas. c Corte coronal del cráneo de Marmoset SP con la ubicación de la sonicación superpuesta (FWHM de la distribución de la presión acústica en el foco) y el ángulo del cráneo (línea verde discontinua tangente al cráneo). Tenga en cuenta que la apertura parece hipointensa en lugar de hiperintensa debido a la alta dosis de GBCA utilizada en este animal. d Apertura resultante con GBCA-MRI in vivo alineado con la TC del mismo animal. e A pesar de la variación en el grosor y el ángulo del cráneo, el tamaño de la abertura de la BHE se vio mínimamente afectado, y la tinción con azul de Evans (imagen de microscopía alineada con la TC) mostró que el volumen de apertura del sitio de sonicación 2 era el 95 % del del sitio de sonicación 1. f, g Mismas imágenes que en (d), pero en cortes sagitales con una línea discontinua verde que muestra el ángulo del cráneo en ese lugar.

a Extravasación de azul de Evans que muestra la interrupción resultante de la BBB en el sitio de ocho sonicaciones, con ciclo de trabajo variado y número de ráfagas en Marmoset SK a 1,7 MPa. b Extravasación de GBCA mediante resonancia magnética in vivo en Marmoset SK. c Igual que (a), para Marmoset M a una presión acústica más baja de 1,17 MPa. d Igual que (b), para Marmoset M. Tenga en cuenta que la secuencia de resonancia magnética varió para los Marmosets SK y M debido a que Marmoset M participó en otros experimentos, pero ambos mostraron claramente contraste GBCA ponderado en T1.

a Objetivo para una sola sonicación en Tití G, área 8a. b Extravasación de azul de Evans como resultado de la sonicación en (a). c Inmunotinción en el corte sonicado, con C1 mostrando el hemisferio izquierdo (no sonicado) y C2 mostrando el hemisferio derecho dentro de los límites del área sonicada. En comparación con el hemisferio izquierdo, un marcado aumento de células Iba1+ fue claramente evidente en el hemisferio derecho. Las células Iba1+ exhiben cuerpos celulares más grandes y procesos gruesos en el hemisferio derecho, mientras que las células Iba1+ muestran procesos mucho más numerosos y finos en el hemisferio izquierdo. d RMN de GBCA in vivo, con bolos de GBCA inyectados a las 2, 5 y 8 h después de la sonicación. Como se muestra en las horas posteriores a las inyecciones en bolo (horas 3 y 4, también horas 6 y 7), el tamaño de la GBCA permaneció igual (es decir, difusión mínima), pero aumentó con las inyecciones en bolo posteriores en las horas 5 y 8, lo que sugiere la BBB todavía estaba abierta a las 8 h después de la sonicación. Cerebro perfundido de Tití G, sitio de sonicación marcado con una flecha roja, lo que indica que no hay evidencia de hemorragia en este sitio. f Objetivo para una sola sonicación en Marmoset M, área 8a. g Extravasación de GBCA, inyectada en forma de bolo 2 h después de la sonicación, luego una segunda inyección en bolo nuevamente después de 2 semanas. Después de 2 semanas, la BBB ya no era permeable al GBCA.

Los titíes SK recibieron 8 sonicaciones y el tití M recibió 6 sonicaciones para determinar la duración del efecto de la ráfaga y el número de ráfagas en el grado de alteración de la BHE y, aunque no fue intencional, la extensión y la naturaleza del daño a alta presión acústica para el tití SK (Fig. 6). ). De hecho, para el tití SK, con una presión y una dosis de microburbujas tan altas, todos los ciclos de trabajo probados (5, 10, 20 y 30 ms) y el número de ráfagas (5, 10, 20, 40) alteraron la BBB en los tití SK. . Sin embargo, estos datos son particularmente útiles para demostrar el alcance del daño que puede ocurrir en los extremos de presión acústica, duración de las explosiones y dosis altas de microburbujas (400 μl/kg), como se muestra en la figura complementaria 3. Para Marmoset M Sin embargo, la presión reducida (1,17 MPa) y la dosis de microburbujas (200 μl/kg) estaban más cerca del límite de los parámetros de sonicación seguros. De los parámetros probados, tan solo 5 ráfagas (duración de ráfaga de 20 ms) o 5 ms de duración de ráfaga (60 ráfagas), descubrimos que probablemente estábamos por encima del mínimo para interrumpir la BBB. Estos datos sugieren que la alteración probablemente se produzca en las primeras explosiones, cuando la concertación de las microburbujas circulantes es mayor. Esto es un buen augurio para aplicaciones en las que las sonicaciones muy rápidas son ventajosas, como las que se administran mientras el animal está despierto y realizando una tarea.

Tití G recibió una única sonicación (área 8a, hemisferio derecho) con un transductor de 1,46 MHz y los siguientes parámetros: presión acústica reducida = 0,95 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60, dosis de microburbujas = 100 µl/kg. Como se muestra en la Fig. 7, la alteración de la BBB se informó mediante resonancia magnética mejorada con GBCA in vivo y tinción con azul de Evan. De los experimentos anteriores y los resultados mostrados en las Figs. 7–9, encontramos que estos parámetros son seguros y efectivos para abrir la BHE. Además de demostrar la seguridad y confiabilidad de la apertura con los parámetros antes mencionados, se buscó determinar el tiempo que BBB permaneció abierta. Como se trataba de un experimento terminal programado (con azul de Evans ya inyectado, lo que impedía la recuperación del animal), no pudimos determinar el límite superior de duración de la interrupción de la BBB. Más bien, nuestro último punto de obtención de imágenes fue 8 h después de la inyección. Como se muestra en la Fig. 7, la BHE todavía estaba claramente abierta a las 8 h después de la sonicación, como lo indica el aumento de intensidad y distribución resultante del GBCA y al inicio de la exploración de 8 h después de la sonicación. A Marmoset M, sin embargo, no se le inyectó azul de Evans y se le inyectó GBCA 2 semanas después de la sonicación; la BBB ya no permitió el paso de un volumen suficiente de GBCA para ser detectado. Tenga en cuenta que las imágenes de la Fig. 6 se adquirieron al mismo tiempo que la imagen de Marmoset M en la Fig. 7 (lo que demuestra que la inyección de GBCA fue exitosa), con extravasación de GBCA en los sitios sonicados 2 semanas después de la primera sonicación 8a.

una imagen de microscopía azul de Evans de sonicación a 0,95 MPa con una dosis de microburbujas de 100 µl/kg en tití G. b Corte de interés teñido con H&E de (a). Los cuadros negros superpuestos a las imágenes H&E muestran la ubicación de la imagen ampliada a continuación. c Imagen GBCA de sonicación a 0,95 MPa con 0,95 MPa con una dosis de microburbujas de 200 µl/kg en Marmoset T. d H&E para (c). e Igual que (a), usando 1,17 MPa con una dosis de microburbujas de 200 µl/kg en Marmoset NE. f H&E para (e). g Igual que (a), Tití T: 1,17 MPa, dosis de microburbujas de 200 µl/kg. h H&E para (g). i Igual que (a), Marmoset SK: 1,7 MPa, dosis de microburbujas de 400 µl/kg. j H&E para (h). k Igual que (a), tití E: 1,7 MPa, dosis de microburbujas de 400 µl/kg. l H&E para (k).

a Volumen de GBCA extravasado al parénquima cerebral en función de la presión acústica reducida. Los diferentes titíes se indican mediante el color de los puntos. La línea discontinua muestra el ajuste de la regresión lineal que tiene en cuenta la varianza debida a la presión reducida. b Extravasación exitosa de GBCA en la BBB en función de la dosis de microburbujas, independientemente de otros parámetros.

Para determinar qué parámetros representaron la mayor variación en la extravasación exitosa de GBCA en toda la BBB, se realizó un análisis de regresión lineal y los datos se visualizan en la Fig. 9a; datos de origen que se encuentran en Datos complementarios 1. Los resultados de la regresión indicaron que dos predictores explicaron el 38,2% de la varianza (R2 = 0,38, F (42) = 5,2, p <0,00). La presión acústica reducida predijo significativamente el volumen extravasado (β = 0,83, p <0,02), mientras que la dosis de microburbujas, el número de ráfagas, los períodos de ráfaga y el peso de los animales no predijeron significativamente el volumen. Cuando se calculó el mismo modelo con regresión por pasos, la presión reducida por sí sola predijo el 31,1% de la varianza (R2 = 0,31, F(46) = 20,7, β = 1,13, p < 0,00). Sin embargo, la dosis de microburbujas se relacionó significativamente con si se logró una apertura de BBB cuantificada mediante una regresión lineal con una variable dependiente binarizada (perturbación de BBB o no). Los resultados indicaron que dos predictores explicaron el 31,3% de la varianza (R2 = 0,31, F(42) = 3,7): dosis de microburbujas (β = 0,00, p = 0,01) y peso del animal (β = 4,62, p = 0,02). Además, independientemente de otros parámetros, la perturbación de BBB se logró en el 50% de las sonicaciones con una dosis de 20 µl, en el 80% de las sonicaciones con 100 µl, en el 89% con 200 µl y en el 100% con 400 µl (ver Fig. 9b).

Para determinar la eficiencia y seguridad de la alteración de la BBB según los cambios en la presión acústica y la dosis de microburbujas, se confirmó tanto la extravasación del azul de Evans como el daño tisular histológico en respuesta a una presión acústica reducida de 0,95, 1,17 y 1,70 MPa con 100, 200 o 400 Dosis de microburbujas µl/kg. Como se muestra en la Fig. 8, se observó extravasación de azul de Evans para una presión acústica reducida de 0,95 MPa y una presión acústica más alta (1,17 y 1,70 MPa). Una presión acústica de 1,70 MPa con una dosis de microburbujas de 400 μl/kg produjo daño tisular grave y grandes grupos de extravasación de eritrocitos en los titíes SK, mientras que una presión acústica de 1,17 MPa facilitó la alteración de la BHE en ausencia de daño tisular aparente o microhemorragias en los titíes G y T. Además, no hubo daño neuronal aparente identificable en esta región al examinar la inmunotinción NeuN (Fig. 7). La expresión de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba1) se regula positivamente tras la activación de la microglía. Por lo tanto, utilizamos la inmunotinción de este marcador microglial como medida de la respuesta inmune. En comparación con el hemisferio contralateral, un marcado aumento en la microglía Iba1+ fue claramente evidente en el hemisferio ipsilateral (Fig. 7). Las células Iba1+ exhibieron cuerpos celulares más grandes y procesos gruesos en el hemisferio ipsilateral, mientras que las células Iba1+ mostraron procesos mucho más numerosos y más finos en el hemisferio contralateral.

Como evaluación adicional de la seguridad, se confirmó el daño histológico del tejido en respuesta a presiones acústicas reducidas de 0,95 y 1,70 MPa con una dosis de microburbujas de 100 o 400 μl/kg (Fig. 10). Una presión acústica de 1,70 MPa con una dosis de microburbujas de 400 μl/kg produjo daño tisular severo y células TUNEL positivas en Tití SK, mientras que una presión acústica de 0,95 MPa facilitó la alteración de la BHE en ausencia de daño tisular aparente o células TUNEL positivas en Tití G. Además, realizamos tinción de inmunofluorescencia adicional en Marmoset G usando dos anticuerpos diferentes (CD68 y CD206). La microglía y los macrófagos asociados a los bordes no se pudieron distinguir sin ambigüedades porque comparten marcadores comunes de microglía/macrófagos. Pudimos identificar la presencia de microglía Iba1+ presumiblemente activada con procesos más cortos y más gruesos en comparación con la microglía de vigilancia normal y más ramificada presente en el hemisferio contralateral. CD68 es un marcador común del linaje de macrófagos, localizado principalmente en la microglía dentro del parénquima cerebral y en los macrófagos perivasculares en los vasos sanguíneos cerebrales y, ocasionalmente, en el parénquima. Aunque existe cierta expresión de CD68 en la microglía en reposo, marca el lisosoma y, por lo tanto, comúnmente se considera un marcador de microglía fagocítica activada. CD206 es una proteína de la superficie celular presente abundantemente en poblaciones seleccionadas de macrófagos. No se observaron cambios notables en el número de células CD68+ o CD206+ en la corteza del tití G (Fig. 10). Había escasos macrófagos CD68+ y CD206+ localizados en el espacio perivascular y las meninges subdurales. Por lo tanto, el principal tipo de células relacionadas con el sistema inmunitario observado en el hemisferio ipsilateral fue la microglía residente.

a Células TUNEL positivas en tejido cerebral (flechas) en tití SK. b Células TUNEL positivas en Tití G. c La expresión de CD68 en Tití G se localizó en el espacio perivascular. d Secciones coronales del cerebro que representan células endoteliales meníngeas subdurales (lectina de tomate, rojo) y macrófagos (CD206, verde).

En este estudio, buscamos establecer los parámetros para alterar focalmente la BHE en una cohorte de monos tití. Al integrar nuestros atlas de tití basados ​​en resonancia magnética25,26 con un sistema de posicionamiento estereotáctico motorizado (RK-50 Marmoset; FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Canadá, Fig. 1), pudimos sonicar focalmente sitios a lo largo de la superficie dorsal del tití. corteza con alta precisión (Figs. 1 a 8 y Fig. 1 complementaria) mediante transductores de un solo elemento enfocados esféricamente. De los dos transductores probados, a 515 kHz y 1,46 MHz, encontramos que el transductor de mayor frecuencia de 1,46 MHz (con una distancia focal de 24,5 mm) permitió interrupciones que podrían limitarse al espesor cortical de ~2,5 a 3 mm de la corteza del tití. . Optimizamos los parámetros (presión acústica mínima, dosis mínima de microburbujas, duración de la ráfaga, número de ráfagas) a partir de los cuales se produjo la interrupción de la BBB sin hemorragia ni edema y en la medida en que se produjo extravasación de azul de Evans y/o GBCA. A partir de estos experimentos, establecemos parámetros para la alteración segura de la BBB (según lo informado por la tinción H&E y la inmunohistoquímica) en el tití a 1,46 MHz. En estos parámetros, encontramos que la unión espacial de la tinción con azul de Evans y el informe GBCA (Fig. 7) eran similares, de modo que la determinación de una alteración de la BBB se puede realizar in vivo con agentes de contraste basados ​​en MRI. En conjunto, los experimentos descritos aquí proporcionan una explicación a partir de la cual se pueden diseñar experimentos de administración de sustancias mínimamente invasivos in vivo.

Al igual que el cerebro de los roedores, los titíes tienen una corteza lisencéfala, lo que convierte a esta especie en un candidato ideal para la alteración de la BHE basada en tFUS, lo que permite sonicaciones a lo largo de la organización columnar de la corteza, libre de los pliegues corticales presentes en la mayoría de las otras especies de primates. Sin embargo, como mostramos aquí, los parámetros de sonicación de especies de roedores (p. ej., ratas, ratones)8 no pueden trasladarse simplemente para su uso en titíes, ni aquellos utilizados en otras especies de primates no humanos más grandes, como los macacos (con un cráneo mucho más grueso). y corteza plegada)4. De hecho, además de los parámetros que controlan el transductor, las propiedades físicas de los transductores también complican las comparaciones (por ejemplo, distancia focal, frecuencia). Los experimentos presentados aquí demuestran que un transductor de 1,46 MHz con enfoque esférico de un solo elemento de 35 mm se puede utilizar para alteraciones corticales en el tití con efectos nocivos mínimos en la morfología de la cabeza del tití (p. ej., grosor del cráneo o presencia de músculos temporales; Fig. 5). , particularmente cuando el centro de atención está en o cerca de la superficie de la corteza (figs. 1 a 8), lo que permite una mayor minimización espacial de la alteración cortical. El uso de un transductor de un solo elemento en lugar de una serie de transductores simplifica los medios necesarios para realizar tFUS en el tití. Utilizamos un sistema de posicionamiento motorizado y una orientación de atlas automatizada, pero estos experimentos también podrían realizarse con un transductor montado en un brazo manipulador estereotáctico, simplificando aún más el equipo necesario para utilizar ultrasonido enfocado para sonicar el cerebro del tití.

Aunque cabe señalar que los experimentos con microburbujas (dosis, tiempo de eliminación) pueden depender de los parámetros y del transductor28, encontramos que la dosis mínima de microburbujas (Definity, Lantheus Medical Imaging, Billerica, MA, EE. UU.), a través de la cola o la safena, vena fue superior a 20 μl/kg cuando se inyectó en forma de bolo (Figs. 3 y 9b para el porcentaje de extravasaciones exitosas de BBB en función de la dosis). Para lograr una distribución más pequeña de microburbujas (donde las burbujas más grandes son más flotantes), extrajimos lo más cerca posible del fondo del vial de microburbujas (después de activarlo e invertir lentamente el vial) con una aguja de calibre 21 y otra de calibre 21. aguja de calibre para ventilar el vial. También optamos por utilizar un catéter de calibre 26 para evitar la destrucción prematura de las microburbujas durante la inyección de nuestra solución de microburbujas diluida en solución salina. Durante los experimentos iniciales, descubrimos que el uso de una extensión con resorte conducía a una perturbación inconsistente de la BBB, probablemente debido al estallido prematuro de las microburbujas. Como tal, todas las inyecciones se realizaron directamente en el conector del catéter. En términos del tiempo de eliminación de las microburbujas, encontramos que es relativamente rápido (<2 min) en el tití, incluso con una dosis alta de 200 a 400 μl/kg, al menos en la medida en que la concentración de microburbujas circulantes provocó la alteración de la BHE. (Figura 4). Descubrimos que las emisiones acústicas indicaban cavitación de las microburbujas a los 30 s, como lo indica el aumento de la señal de banda ancha alrededor del subarmónico. En particular, de acuerdo con informes anteriores en ratas8 que utilizaron un transductor y un hardware de hidrófono similares, el ruido de banda ancha subarmónico fue evidente a los 30 y 120 s después de la inyección en bolo de microburbujas (Figura complementaria 2); Vale la pena señalar que nuestro hidrófono estaba sensibilizado a la cavitación subarmónica en lugar de a señales ultraarmónicas, con una sensibilidad de ~73 kHz órdenes de magnitud mayor que en las frecuencias armónicas y ultraarmónicas. Esto probablemente correspondió a la cavitación de microburbujas, aunque no correspondió a la apertura a los 120 s después de la inyección de microburbujas. Este efecto subarmónico no fue evidente a los 240 o 480 s después de la inyección de microburbujas.

Nuestra intención original de determinar la alteración de la BBB en función de la duración y el número de ráfagas no era evaluar el daño (visible a simple vista, Fig. 6), sino, como lo muestra la tinción H&E (Fig. 3 complementaria), la presión utilizado para los titíes SK estaba por encima de lo que se puede considerar seguro (Fig. 8). Estos datos, sin embargo, son particularmente útiles para demostrar el alcance del daño que puede ocurrir en los extremos de presión acústica, duración de las explosiones y dosis altas de microburbujas (400 μl/kg). Descubrimos que estas sonicaciones provocaron daño tisular difuso generalmente acompañado de microhemorragias. De particular interés encontramos que el espacio subdural presentaba hemorragia. Esta zona es especialmente sensible a las hemorragias debido a la presencia numerosa de arterias perforantes en un espacio compacto y, por tanto, la concentración de microburbujas puede haber sido mayor. En comparación con otras especies, las presiones reducidas (Fig. 9) están en consonancia con la apertura segura de la BHE y también con la presión que causa daño al tejido cortical, con índices mecánicos que aquí oscilan entre ~0,26 y 1,4029,30,31,32,33,34. 35,36,37. Es importante señalar que, aunque sonicamos múltiples ubicaciones con el fin de probar los parámetros de apertura, puede ocurrir una redisrupción asociada con inflamación estéril38,39 al sonicar ubicaciones adyacentes. Aquí, sonicamos una rejilla con una distancia mínima de 8 mm, con las excepciones de los titíes T y G en los que se produjeron 4 sonicaciones adicionales a lo largo de la corteza parietal (aunque, como se muestra en la Fig. 4, esas sonicaciones no dieron como resultado la apertura de la BBB). . Como tal, los parámetros presentados aquí deben considerarse para sonicaciones únicas (o sonicaciones múltiples escasamente espaciadas), no para sonicaciones proximales repetidas como se muestra en la ref. 38.

Dados los resultados de la tinción H&E de los animales que mostraron interrupciones exitosas y confiables de la BBB (Figs. 2-6), aplicamos lo que consideramos parámetros seguros (presión acústica reducida = 0,95 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, duración de la ráfaga = 20 ms, período = 1000 ms, número de ráfagas = 60, dosis de microburbujas = 100 μl/kg) a un sitio frontal (área 8a) en tití G para determinar el tiempo que la BHE permaneció abierta, según lo indexado por la permeabilidad a un bolo de GBCA a las 2, 4 y 8 h después de la sonicación. La BHE estaba claramente abierta a las 8 h después de la sonicación, como lo indica el aumento de intensidad y distribución resultante del GBCA y al inicio de la exploración de 8 h después de la sonicación (Fig. 7). Aunque esta alteración de larga duración puede presentar algún riesgo (p. ej., bacterias transmitidas por la sangre) que la BHE normalmente protegería contra toxinas o patógenos circulantes en el torrente sanguíneo40, es una ventana de tratamiento experimentalmente ventajosa para inyectar sustancias que pueden ser peligrosas si se inyectan como un bolo, en lugar de una infusión lenta. La histología y la inmunohistoquímica en tití G respaldaron los resultados anteriores de que los parámetros eran seguros, de modo que no se observaron daños fácilmente aparentes en la tinción con H&E (Figs. 8 y 10). Hay una activación microglial visible (Fig. 7) debido a la perturbación del tejido (Iba1), pero no al daño tisular (DAPI, NeuN, H&E) en comparación con un sitio 8a contralateral no sonicado, lo que indica que estos son parámetros seguros y confiables para abrir la BBB. por un período prolongado. La microglia en las regiones corticales mostró signos de activación a través de una mayor expresión de Iba1 y cambios en los cuerpos y procesos celulares, sin cambios significativos en el número de células. Se ha demostrado que la alteración de la BHE inducida por FUS desencadena una activación glial transitoria38. Dependiendo del tipo y la gravedad de la lesión cerebral, la microglía activada y los macrófagos infiltrados pueden exacerbar la neuroinflamación y la neurodegeneración. Sin embargo, se ha demostrado que la activación de la microglía se resolvió 15 días después de la FUS sin progresión a una cicatriz glial, lo que sugiere que la FUS no causa microgliosis similar a una lesión41.

En resumen, demostramos una interrupción segura y eficaz de la BHE en el tití con una especificidad espacial de ~1 mm radialmente y 2,5 mm axialmente (en la corteza) utilizando un transductor de 1,46 MHz. Pudimos perturbar de manera confiable la BBB a través de la superficie dorsal de la corteza del tití con una presión acústica mínima reducida entre 0, 95 y 1, 16 MPa y una dosis mínima de microburbujas de 20 μl / kg mediante inyección en la vena de la cola. Además, encontramos que, en promedio, en todo el cráneo del tití, la presión acústica a 1,46 MHz se redujo en un 47%. Demostramos que estos parámetros (junto con 60 ráfagas de 20 ms, espaciadas a 1000 ms) hicieron que la BBB estuviera abierta durante más de 8 h y no provocaron daño al tejido cortical, como lo informó la tinción con H&E. De acuerdo con informes anteriores en otras especies, encontramos que la presión acústica representó la mayor variación entre las variables analizadas y se relacionó linealmente con el volumen de extravasación32,42,43. Presiones acústicas más altas y/o una dosis excesiva de microburbujas (>200 μl/kg) provocaron daño tisular (Fig. 8). La serie de experimentos presentados aquí establecen métodos para perturbar de forma segura, reproducible y focalizada la BBB utilizando tFUS en el mono tití común.

Nueve titíes adultos (Callithrix jacchus) contribuyeron con datos a este estudio (Tabla complementaria 1). Los animales fueron anestesiados (inducidos y mantenidos) con isoflurano al 2% administrado mediante máscara tanto para los procedimientos tFUS como para los procedimientos de resonancia magnética in vivo. Durante los procedimientos se monitoreó la frecuencia cardíaca, la oxigenación de la sangre, la respiración y la temperatura rectal. Se afeitó la cabeza con maquinilla y luego se eliminó el vello restante con crema depilatoria. Se colocó un catéter de calibre 26 (1/2 o 3/4 de pulgada de longitud) en la cola lateral o en la vena safena para la administración de microburbujas y agente de contraste. La temperatura corporal se mantuvo con mantas de agua calentada o infrarroja. El procedimiento experimental cumplió con las pautas éticas para pruebas con animales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh.

Las sonicaciones se realizaron con el RK-50 Marmoset (FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Canadá), que fue desarrollado para su uso en titíes en colaboración con FUS Instruments para implementar hardware específico para titíes, incluido un dispositivo estereotáxico para titíes (Modelo SR-AC ; Narishige International Incorporated, Amityville, Nueva York, EE. UU.) e incluir un atlas de titís basado en resonancia magnética para la focalización estereotáxica25,26 (Fig. 1). El sistema utiliza un sistema de posicionamiento automático de 3 ejes que se configura con referencia a la posición estereotáctica en la estación de trabajo de planificación del tratamiento que ejecuta el software MORPHEUS (marco MORPHEUS, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Canadá). El sistema de posicionamiento de 3 ejes guió uno de los dos transductores calibrados y enfocados esféricamente de 35 mm utilizados en este estudio; un transductor de 515 kHz o 1,46 MHz (FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Canadá) se montó rígidamente en el sistema de posicionamiento para permitir para un control preciso de la ubicación de la sonicación. Los parámetros de sonicación (amplitud, número de pulsos, período de repetición y número de ráfagas) se configuraron en el paquete de software MORPHEUS. Para cada transductor, los valores de tensión a presión fueron calibrados por el fabricante y, como se describe en la siguiente sección, validamos el rendimiento del transductor de 1,46 MHz en el sitio. El número de ventajas, el período de repetición y el número de ráfagas comandadas por el software se generaron mediante un generador de formas de onda externo (Siglent SDG 1032X, Siglent Technologies, Solon, Ohio, EE. UU.) y se enviaron a través de un amplificador de 15 W al transductor. Se utilizó un osciloscopio digital para monitorear las emisiones de cavitación del hidrófono, que estaba montado concéntricamente con los transductores. Como se ilustra en la Fig. 1a, el transductor se selló con una cubierta impresa en 3D con una junta tórica y una cara de película de poliimida que contenía agua desgasificada (a través de un desgasificador de agua portátil; FUS-DS-50, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON). , Canadá). El sensor y la cubierta se sumergieron en un tanque que contenía ~300 ml de agua desgasificada. La base de poliimida del tanque se acopló con la cabeza mediante gel de ultrasonido.

Para validar el rendimiento del sistema FUS y cuantificar con precisión qué parámetros corresponden al daño o inflamación del tejido, medimos la salida de mesa del transductor de 1,46 MHz utilizando un hidrófono de cápsula (HGL-0085, ONDA Corporation, Sunnyvale, CA, EE. UU.) y digital. osciloscopio (WaveRunner 6051A, Teledyne LeCroy, Chestnut Ridge, NY, EE. UU.). La duración del pulso (2 ms), el período de ráfaga (500 ms) y la frecuencia (1,46 MHz), así como la linealidad del voltaje negativo máximo (entre 0,2 y 3,8 MPa) se ordenaron a través del software MORPHEUS y se confirmaron mediante lecturas de hidrófonos en un baño de agua desgasificada. con el hidrófono colocado en el centro de enfoque con un soporte rígido de transductor a hidrófono.

Una vez corroborada la precisión temporal, probamos la precisión espacial del transductor de 1,46 MHz, montado en el mismo posicionamiento de 3 ejes que utilizamos para apuntar a los titíes. Para hacerlo, diseñamos y fresamos (Roland Modela MDX-50) una placa acrílica personalizada (polimetacrilato de metilo, #8589K922, McMaster-Carr Supply Company, Elmhurst, IL, EE. UU.) para montarla en los tornillos de mariposa de la barra de oreja del estereotax. , luego centrado en la misma posición relativa que el cerebro del tití (ver Figura complementaria 1a). Se eligió el acrílico por su punto de fusión relativamente bajo de 160 grados C y su módulo de flexión relativamente alto de 490 kip/si, de modo que pudiera fresarse con precisión, montarse en el estereotáxico con una flexión mínima, y ​​al mismo tiempo fundirse con una entrada de energía mínima, minimizando el potencial. daños al elemento transductor. La duración de una sonicación de onda continua se incrementó hasta que se produjo la fusión (10 s a 2,2 MPa), luego se sonicaron 24 puntos en una cuadrícula de 20 × 20 mm, con un espacio de 5 mm entre los puntos y el punto central (que representa 0 mm) definido por un punto fresado desde el cual se alinearon las coordenadas estereotácticas (consulte la figura complementaria 1b). Después de fundir la rejilla de puntos, la placa acrílica se colocó en un baño de yodo potásico de 200 ml a 5 mM (M5005; Sigma-Aldrich Co., MO) y se escaneó con una tomografía computarizada de animales pequeños (Si78; Bruker BioSpin GmbH, Ettlingen, Alemania). ) utilizando un filtro de aluminio de dosis baja de 1 mm, resolución de 200 × 200 × 200 μm (campo de visión = 79,6 × 81,1 mm) y un método de “paso y disparo” (paso de pórtico de 0,6 grados) y reconstruido utilizando el algoritmo de retroproyección filtrada . Al sumergir la placa en yodo, pudimos ver mejor los contornos del acrílico derretido, en comparación con el escaneo al aire libre (Figuras complementarias 1c a f). Para comparar la lámina acrílica derretida con las ubicaciones de destino, generamos un archivo CAD 3D con las ubicaciones de destino ideales, convertimos ese archivo al formato NIfTI y lo registramos en la imagen CT según el punto cero fresado (Figura complementaria 1f, d) usando FSLeyes (Biblioteca de software FMRIB)44. Una vez alineado, se determinó el pico del área derretida para cada punto y las desviaciones espaciales (distancia euclidiana) de la ubicación ideal se analizaron utilizando MATLAB 2023a (Mathworks) y se trazaron utilizando las funciones integradas carcaj e imágenesc.

Utilizando un transductor de 1,46 MHz y la configuración del hidrófono descrita anteriormente, probamos la reducción de sonicaciones de 2,2 MPa a través de seis cráneos de tití desgasificados y comparamos esos valores con mediciones de campo libre en agua desgasificada. Promediando 6 casquetes craneales de tití adultos (cortados en plano estereotáctico, comenzando en la parte superior de la cresta del ojo, pero completamente intactos en la parte dorsal), encontramos que en promedio la reducción fue del 47% con el cuero cabelludo afeitado, y del 44% con solo el cráneo y el músculo adjunto (se probaron sistemáticamente entre 35 y 42 puntos en cada cráneo, según el tamaño del cráneo, y espaciados a 2 mm). Como tal, utilizamos el valor promedio del 53% para reducir nuestros valores ordenados en todo el manuscrito. Utilizando estas mismas muestras, también comparamos el efecto de atenuación del hueso sin músculo adherido (en la línea media) con el de la porción más gruesa del músculo temporal, donde el hueso también era más grueso (a 10 mm lateral desde la línea media y 5 mm anterior a la línea media). el plano interaural). Donde el hueso y el músculo eran más gruesos, hubo un 2,5% adicional de atenuación. Cuando se colocó un músculo temporal desprendido entre el transductor y el hidrófono, no se observó ningún efecto de atenuación mensurable y, por lo tanto, este efecto se debió únicamente al grosor del hueso o al ángulo del cráneo.

Las sonicaciones se aplicaron transcranealmente (con la piel intacta, solo se eliminó el vello) según la posición estereotáxica, con x = 0, y = 0, z = 0 mm correspondiente a la mitad del camino entre el centro de las barras de la oreja, en el plano con la parte inferior de la órbita. barras. El estereotax específico para tití se montó rígidamente en la placa base RK-50 Tití con tornillos de mariposa. Luego se especificaron los sitios de sonicación en función de la ubicación deseada en el espacio estereotáctico (Fig. 1b, por ejemplo). Para la co-localización con puntos de referencia del atlas funcionales y estructurales en el cerebro del tití, el software de posicionamiento tFUS (marco MORPHEUS, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Canadá) se integró con los atlas marmosetbrainmapping.org45 y marmosetbrainconnectome.org26. Junto con los límites citoarquitectónicos derivados del atlas cerebral de los titíes de Paxinos24, el software Morpheus permitió un posicionamiento preciso del transductor con referencia al cerebro de los titíes adultos.

Inmediatamente antes de la sonicación (<1 min), se administraron microburbujas (Definity, Lantheus Medical Imaging, Billerica, MA, EE. UU.) a través de un catéter de cola lateral o de vena safena para ayudar en la interrupción de la BHE. Se inyectaron soluciones de microburbujas directamente en el conector del catéter; Se eligió un catéter de calibre 26 para reducir la probabilidad de destrucción prematura de microburbujas. La concertación (20–400 μl/kg) de microburbujas varió entre los experimentos (detallados a su vez), pero todas las inyecciones se prepararon en una solución madre (100 μl de microburbujas/860 μl de solución salina estéril) en una jeringa de 1 ml (peso (kg) × concertación de microburbujas (ml/kg) × 9,6 = volumen de inyección (ml)) para todos los experimentos. La solución se inyectó en forma de bolo y se lavó con 200 µl de solución salina estéril para garantizar que las microburbujas limpiaran el volumen del conector del catéter.

Se utilizó tinción azul de Evans y un agente de contraste para resonancia magnética a base de gadolinio (GBCA) para verificar la alteración de la BHE. Todos los agentes se inyectaron inmediatamente después de la última sonicación en forma de bolo (aunque el momento de la inyección varió según la duración de la interrupción de la BBB y los experimentos de eliminación, que se detallan a continuación). Se inyectó por vía intravenosa azul de Evans (E2129; Sigma-Aldrich Co., MO) en forma de bolo en todos los animales a una dosis de 2 μl/g en una solución al 2%, preparada en agua esterilizada. Se preparó gadolinio (GadavistTM, gadobutrol; Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Leverkusen, Alemania) en 200 µl de solución salina estéril y se inyectó a una dosis de 100 µl/kg en todos los titíes excepto en los titíes G (200 µl/kg) y SP (600 µl/kg). kg).

Tití B recibió dos sonicaciones en las cortezas parietales para determinar la diferencia relativa en el tamaño de la interrupción de la BBB en función de la frecuencia central del transductor (Fig. 1c). Con informes anteriores de alteración confiable de la BHE en ratas (que tienen un grosor de cráneo y un tamaño de cerebro similares a los de los titíes) a ~500 kHz y su armónico ~1,5 MHz29 probamos un transductor de 515 kHz y 1,46 MHz, pero a medida que avanzamos para mostrar , el tamaño de apertura de 1,46 MHz fue más adecuado para los experimentos descritos en este estudio y, por lo tanto, todas las demás sonicaciones se realizaron a 1,46 MHz. La única sonicación realizada a 515 kHz fue en la corteza parietal izquierda del tití B (1 MPa ordenado, reducido ~0,5 MPa), duración de ráfaga de 30 ms, período de ráfaga de 1000 ms, 90 ráfagas, dosis de microburbujas de 400 μl/kg). La corteza parietal derecha en el mismo animal se sonicó con un transductor de 1,46 MHz (1,70 MPa (reducido), duración de ráfaga de 30 ms, período de ráfaga de 1000 ms, 90 ráfagas, dosis de microburbujas de 400 μl/kg). La alteración de la BBB se informó mediante tinción con azul de Evans ex vivo.

Para este experimento, los titíes SG, NE y T recibieron cada uno cinco u ocho sonicaciones corticales (área 8a, 4ab, MIP y V2) con un transductor de 1,46 MHz. La Figura 2 muestra las ubicaciones de sonicación y las presiones acústicas reducidas que las acompañan. Para Marmoset SG, la presión acústica se moduló manteniendo constantes los siguientes parámetros: duración de la ráfaga = 30 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 90, dosis de microburbujas = 400 μl/kg. Según la información obtenida de Marmoset SG, los titíes NE y T fueron sonicados a presiones acústicas más bajas con los siguientes parámetros permaneciendo constantes: duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60, dosis de microburbujas = 200 μl/ kg. El propósito de este experimento fue triple: (1) determinar la presión acústica mínima para abrir la BBB en un tití a 1,46 MHz, (2) determinar el tamaño/forma de la alteración de la BBB en función de la presión acústica, y (3) determinar la presión a la cual el daño comienza a ocurrir. Para los tres animales, la alteración de la BBB se informó mediante resonancia magnética mejorada con GBCA in vivo y tinción con azul de Evans ex vivo. El daño tisular se evaluó mediante tinción H&E (detallada a continuación).

Se utilizaron titíes NE y T para determinar la dosis mínima de microburbujas necesaria para abrir la BHE. Cada animal fue sonicado cuatro veces (área 8a, 4ab, MIP y V2), con diferentes dosis de microburbujas de 0 a 200 μl/kg (la Fig. 3 muestra dosis en ubicaciones específicas), permaneciendo constantes los siguientes parámetros: presión acústica reducida = 1,17 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60. Transcurrieron diez minutos entre las sonicaciones y las inyecciones de microburbujas para reducir los efectos de confusión de las microburbujas circulantes. Tenga en cuenta que los titíes NE y T participaron tanto en el experimento de presión acústica (arriba) como en el de dosificación de microburbujas (aunque en sitios de sonicación separados, excepto en el 8aD izquierdo, que informó ambos experimentos). Para ambos animales, la alteración de la BBB se informó mediante resonancia magnética mejorada con GBCA in vivo y tinción con azul de Evans ex vivo. El daño tisular se evaluó mediante tinción H&E.

Los titíes T y M recibieron cuatro sonicaciones (áreas parietales PFG derecha, PE derecha, PE izquierda y PFG izquierda; aunque loci ligeramente diferentes, consulte la Fig. 4 para ubicaciones de mono) para determinar la capacidad de abrir la BBB en múltiples sitios después una única inyección en bolo de microburbujas. La Figura 4 muestra ubicaciones de sonicación separadas a partir de 30, 60, 90, 120, 240 y 480 s después de una inyección en bolo de 200 μl/kg de microburbujas. Para todos los sitios, se utilizó un transductor de 1,46 MHz siguiendo los parámetros que permanecieron constantes: presión acústica reducida = 1,17 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60. La interrupción de la BBB se informó mediante GBCA mejorada in vivo. Resonancia magnética (tenga en cuenta que la secuencia de resonancia magnética varió para los titíes T y M, pero ambos mostraron claramente contraste GBCA ponderado en T1) y tinción con azul de Evans ex vivo. El daño tisular se evaluó mediante tinción H&E. Los espectros de frecuencia de las emisiones acústicas se generaron utilizando una transformada rápida de Fourier y se promediaron entre pulsos (Figura complementaria 2).

Marmoset SP recibió dos sonicaciones (izquierda: 6DC; derecha: área 6VA). A diferencia de los experimentos anteriores, las sonicaciones no se administraron simétricamente: las sonicaciones del hemisferio derecho se trasladaron lateralmente desde las sonicaciones del hemisferio izquierdo para variar adicionalmente el ángulo del cráneo a lo largo del eje medial-lateral (Fig. 5 para las ubicaciones). Ambas sonicaciones utilizaron los siguientes parámetros con un transductor de 1,46 MHz: presión acústica reducida = 1,70 MPa, duración de la ráfaga = 30 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 90, dosis de microburbujas = 400 μl/kg. Se adquirió una imagen de tomografía computarizada (TC) de alta resolución para calcular el ángulo del cráneo y se registró en el espacio de la plantilla25. El tamaño de la interrupción de la BBB se calculó con el paquete de software FIJI46 basándose en las imágenes de microscopía de tinción con azul de Evans (Fig. 5e).

Los titíes SK recibieron 8 sonicaciones en total (área 8a, 4ab, MIP y V2 bilateralmente). En el hemisferio izquierdo, el ciclo de trabajo varió de 5 a 20 ms (Fig. 6 para el ciclo de trabajo por ubicación), con los siguientes parámetros mantenidos constantes con un transductor de 1,46 MHz: presión acústica reducida = 1,70 MPa, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60, dosis de microburbujas = 400 µl/kg. En el hemisferio derecho, el número de ráfagas varió de 5 a 40 ráfagas (Fig. 6 para el número de ráfagas por ubicación), manteniéndose constantes los siguientes parámetros con un transductor de 1,46 MHz: presión acústica reducida = 1,70 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, dosis de microburbujas = 400 μl/kg. Marmoset M recibió 6 sonicaciones en total con el mismo transductor de 1,46 MHz, pero con parámetros y dosis de microburbujas reducidos que el tití SK: presión acústica reducida = 1,17 MPa, período de ráfaga = 1000 ms, dosis de microburbujas = 200 μl/kg. En el hemisferio izquierdo (Fig. 6 para las ubicaciones), la duración de la ráfaga varió de 5 a 20 ms; en el hemisferio derecho, el número de ráfagas varió de 5 a 20 ráfagas (tenga en cuenta, nuevamente, que la secuencia de resonancia magnética varió para los titíes SK y M, pero ambos mostraron claramente contraste GBCA ponderado en T1).

Tití G recibió una única sonicación (área 8a, hemisferio derecho) con un transductor de 1,46 MHz y los siguientes parámetros: presión acústica reducida = 0,95 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60, dosis de microburbujas = 100 µl/kg. La alteración de la BBB se informó mediante resonancia magnética mejorada con GBCA in vivo. Para determinar el tiempo que la BBB permaneció abierta, a Marmoset G se le administraron tres inyecciones en bolo de GBCA a las 2, 5 y 8 h después de la sonicación. Se recopilaron imágenes anatómicas MPRAGE (secuencia que se detalla a continuación) cada hora para determinar los cambios en el tamaño y la intensidad del GBCA que pasa la BHE al parénquima. La alteración de la BBB también se informó a través del azul de Evans, inyectado inmediatamente después de la última sonicación. El daño tisular se evaluó mediante tinción H&E, acompañada de IBa1, NeuN y DAPI. Marmoset M también recibió una única sonicación en el área 8a (presión acústica reducida = 1,17 MPa, duración de la ráfaga = 20 ms, período de ráfaga = 1000 ms, número de ráfagas = 60, dosis de microburbujas = 200 μl/kg), pero se administró GBCA a las 2 h, luego un período mucho más largo de 2 semanas después de la sonicación. Dado el tiempo de supervivencia necesario para el experimento (2 semanas), Marmoset M no recibió azul de Evans.

Todas las neuroimágenes (MRI y CT) se realizaron en el Brain Institute de la Universidad de Pittsburgh. Para la resonancia magnética, se utilizó un escáner de diámetro horizontal de 9,4 T y 30 cm (Bruker BioSpin Corp, Billerica, MA), equipado con una consola Bruker BioSpec Avance Neo y el paquete de software Paravision-360 (versión 3.2; Bruker BioSpin Corp, Billerica, MA) y una bobina de gradiente personalizada de alto rendimiento de 17 cm (Resonance Research Inc, Billerica, MA) que funciona con una resistencia de gradiente de 450 mT/m. Para detectar la alteración de la BBB in vivo, se adquirió resonancia magnética en titíes B, SG, NE, T, M, SK, SP y G junto con un agente de contraste intravenoso (gadolinio) que se inyectó después de las sonicaciones (dentro de 1 minuto de las últimas sonicaciones). , excepto Marmoset E para determinar la duración de la interrupción de la BBB) y antes de la resonancia magnética (la resonancia magnética comenzó dentro de los 20 minutos posteriores a la transferencia del animal desde el FUS, incluidas las preparaciones del escáner que implicaban localización y compensación del campo magnético). La transmisión de radiofrecuencia se logró con una bobina personalizada de 135 mm de diámetro interior y se utilizó una bobina personalizada de 8 canales de matriz en fase específica para titíes para la recepción de radiofrecuencia. Se tomaron imágenes de titíes en posición de esfinge, con un casco personalizado impreso en 3D para fijar la cabeza y una máscara de anestesia para la administración de isoflurano inhalado. Se empleó una secuencia de disparo rápido de ángulo bajo (FLASH) ponderada en T1 para detectar el acortamiento resultante de los tiempos de relajación de T1 debido a que los agentes de contraste ingresan al parénquima a través de la interrupción de la BHE. Se adquirieron tres exploraciones (posteriormente promediadas) para cada animal con los siguientes parámetros: TR = 25 ms, TE = 8 ms, campo de visión = 35 × 35 × 26 mm, tamaño de matriz = 117 × 117 × 87, tamaño de vóxel = 0,299 × 0,299 × 0,299 mm, ancho de banda = 200 kHz, ángulo de giro = 25 grados, tiempo total de exploración = 9 min, 2 s. Para los titíes G y M, se utilizó una secuencia de eco de gradiente rápido preparada con magnetización (MPRAGE) en lugar de la secuencia FLASH debido a los efectos longitudinalmente aditivos del GBCA sistémico sobre el contraste dinámico de la señal. Con la secuencia MPRAGE, este efecto aditivo se reduce con el pulso de inversión adicional. La secuencia MPRAGE se adquirió con los siguientes parámetros: TR = 6000 ms, TE = 3,42 ms, campo de visión = 42 × 35 × 25 mm, tamaño de matriz = 168 × 140 × 100, tamaño de vóxel = 0,250 × 0,250 × 0,250 mm, ancho de banda = 50 kHz, ángulo de giro = 14 grados, tiempo total de exploración = 20 min, 6 s.

Para cuantificar con precisión el ángulo del cráneo en relación con el transductor ultrasónico, se adquirió una TC en Marmoset SP del Instituto del Cerebro de la Universidad de Pittsburgh en un TC de animal pequeño (Si78; Bruker BioSpin GmbH, Ettlingen, Alemania) equipado con el paquete de software Paravision-360 (versión 3.1; Bruker BioSpin Corp, Billerica, MA). Utilizando un filtro de aluminio de dosis baja de 1 mm, se adquirió una TC de 200 × 200 × 200 μm (campo de visión = 79,6 × 81,1 mm) utilizando un método de “paso y disparo” (paso de pórtico de 0,6 grados) y se reconstruyó utilizando el filtro posterior filtrado. Algoritmo de proyección. Luego, las imágenes de resonancia magnética y de microscopía cortada se alinearon utilizando el registro de 2D a 3D proporcionado en DSIstudio47.

La cuantificación del “tamaño de apertura” de la BHE se calculó con las resonancias magnéticas posteriores a la sonicación de los titíes SG, SK, NE, T, G y M midiendo el volumen de GBCA extravasado en el centro del punto de sonicación respectivo en el complemento Draw Dataset de AFNI48. Los volúmenes resultantes se calcularon utilizando 3dROIstats de AFNI y se cargaron en MATLAB 2023a (Mathworks) para realizar análisis estadísticos adicionales entre animales y parámetros. Realizamos una regresión lineal (funciones "fitlm" y "stepwiselm", Caja de herramientas de estadística y aprendizaje automático) con variables de entrada de presión acústica reducida, dosis de microburbujas, número de ráfagas, período de ráfaga y peso del animal. El volumen calculado de GBCA extravasado fue la variable dependiente. Se realizaron tres análisis de regresión total: (1) regresión lineal de las variables antes mencionadas, con el volumen de extravasación como variable dependiente, (2) lo mismo, pero como una regresión por pasos, y (3) las mismas variables independientes en una regresión lineal. pero con el volumen de extravasación binarizado (es decir, 1 = contraste de gadolinio detectado, 0 = no se detectó contraste GBCA).

Después de la adquisición de resonancia magnética in vivo (y de 6 a 8 h después de las sonicaciones), los nueve titíes fueron sacrificados con solución de pentobarbital sódico y fenitoína sódica (100 mg/kg) para examen histológico. La perfusión transcardial se realizó con paraformaldehído al 4%. Los cerebros se extrajeron, se fijaron posteriormente y se crioprotegieron en sacarosa al 30% durante 3 a 5 días. Los cerebros de tití se seccionaron coronalmente a 30 μm usando un criostato (Leica CM1950, Deer Park, IL, EE. UU.) y se almacenaron en una solución crioprotectora con 15% de glicerol y 15% de etilenglicol a -20 °C hasta su uso posterior. Para la fluorescencia azul de Evans, las secciones se montaron en portaobjetos Superfrost (Fisher Scientific) y se visualizaron bajo un microscopio de epifluorescencia AxioImager M2 (Car Zeiss, White Plains, NY, EE. UU.). Para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), las secciones se montaron en un portaobjetos Superfrost y se tiñeron con un kit de tinción H&E (#3502 Vector Laboratories, Newark, CA, EE. UU.) siguiendo los procedimientos sugeridos por el fabricante. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio AxioImager M2 (Carl Zeiss). Para la tinción por inmunofluorescencia, las secciones flotantes se permeabilizaron en tampón de bloqueo (suero de burro al 2 % y Triton X-100 al 0,2 % en PBS) a temperatura ambiente durante 1 h con agitación suave, seguido de una incubación durante la noche con anticuerpos primarios, Iba1 (Ionized calcio-binding). molécula adaptadora 1—1:500; #019-19741 Wako Chemicals) y NeuN (Fox-3—1:500; #MAB377 MilliporeSigma) a 4 °C. Después del lavado con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes, IgG anti-conejo de burro conjugada con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) y IgG anti-ratón de burro conjugada con Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Las secciones se tiñeron con DAPI (diclorhidrato de 4',6-diamidina-2'-fenilindol - Invitrogen) para teñir los núcleos. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal LSM900 (Carl Zeiss) con un objetivo de ×10 a una resolución de 1024 × 1024 píxeles con un tamaño de paso z de 1 μm de espesor.

Como evaluación más sensible del daño38, se realizó tinción TUNEL adicional (PK101; FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, EE. UU.) en Marmoset G y SK. También se utilizaron CD68 (MCA1957; Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) y CD206 (ab64693; abcam, Waltham, MA, EE. UU.) para teñir rodajas de Tití G como marcador de microglía fagocítica activada. Se utilizó inmunotinción contra GFAP (C9205; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) para identificar los astrocitos. Se utilizaron lectina (DL-1174-1; Vector Laboratories, Newark, CA, EE. UU.) y el marcador nuclear DAPI (62248; Thermo Fisher Scientific) para visualizar los vasos sanguíneos.

Los parámetros (presión acústica, dosis de microburbujas, número de ráfagas, período de ráfaga) se variaron y probaron en varios animales de diferentes edades, pesos y sexos (Tabla complementaria 1). El volumen de apertura de BBB se cuantificó utilizando GBCA MRI in vivo utilizando el complemento Draw Dataset de AFNI y 3dROIStats. Las estadísticas se realizaron utilizando una combinación de código interno y código integrado de Statistics and Machine Learning Toolbox de MATLAB, específicamente las funciones "fitlm" y "stepwiselm". Se realizó una regresión lineal entre animales y se utilizaron todos los parámetros variados, así como el peso del animal.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Datos disponibles previa solicitud razonable de los autores. Los datos de origen para la Fig. 9 se pueden encontrar en Datos complementarios 1.

Código disponible previa solicitud razonable de los autores.

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Deseamos agradecer a Brianne Stien, Lauren Dubberly y la Dra. Julia Oluoch por el cuidado y la preparación de los animales. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Institutos Nacionales de Salud con el número de premio R21NS125372 (DJS) y por los Fondos de Apropiación del Tabaco del Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) del Departamento de Salud de Pensilvania: Fase 18 (SAP 4100083102; SCA). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no necesariamente representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Departamento de Neurobiología, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE. UU.

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TVP, DS, SC, AA, YM, ACS y DJS diseñaron y realizaron investigaciones. TVP, DS, SC y DJS analizaron datos. TVP y DJS escribieron el manuscrito. TVP, DS, SC, AA, YM, ACS y DJS editaron el manuscrito.

Correspondencia a David J. Schaeffer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Karli Montague-Cardoso y Joao Valente.

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Parques, TV, Szuzupak, D., Choi, SH. et al. Alteración no invasiva de la barrera hematoencefálica en el mono tití. Común Biol 6, 806 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05185-3

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Recibido: 21 de noviembre de 2022

Aceptado: 26 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05185-3

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